增益素（多抗甲素）对鸡免疫功能和生长性能的影响

西北农林科技大学2003届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文
增益素(多抗甲素)对鸡免疫功能和生长性能的影响
指导教师：张彦明教授
完成时间：2003年12月
论文提交时间：2003年12月
论文答辩时间：2003年12月
学位授予时间：2003年12月
学位授予单位：西北农林科技大学
摘要
多抗甲素（PolyactinA，PAA）是一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的多糖类物质，化学成分为α-甘露聚糖肽物质，属于一种糖蛋白，为我国首创的一种新型免疫增强剂。多抗甲素作为一种生物活性多糖类物质，具有广泛的生物活性。
近年来，将多抗甲素用于家畜、家禽疾病的预防和治疗上，生产上取得了较好的效果，一般认为其具有增强动物免疫功能，提高机体对各种疾病的抵抗力，并能促进动物对营养物质的吸收和利用。本试验以雏鸡为动物模型来研究多抗甲素（其产品商品名为增益素）对鸡接种新城疫疫苗后免疫功能（T细胞、B细胞和巨噬细胞吞噬功能）的影响和对肉鸡的抗感染能力和促进生长的影响。结果表明：
1.饲喂增益素（多抗甲素）的鸡接种新城疫疫苗后，其血清抗鸡新城疫病毒（NDV）抗体水平在不同的测定时间内均高于不饲喂增益素（多抗甲素）的鸡；在免疫接种后第10d和21d明显高于不饲喂增益素（多抗甲素）的鸡（p﹤0.01）。
2.饲喂增益素（多抗甲素）的鸡淋巴细胞活化指数在不同的测定时间内均高于相应的对照组；在首次免疫接种后21d（p﹤0.05）和27d（p﹤0.01）明显高于不饲喂增益素（多抗甲素）的鸡。
3.饲喂增益素（多抗甲素）的鸡腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均高于未饲喂增益素（多抗甲素）的鸡。
4.添加增益素（多抗甲素）组的鸡发病率和死亡率都显著低于不饲喂组（p﹤00.1或p﹤0.05）；并可使鸡的体重明显增加，降低料肉比。
5.上述结果说明，增益素（多抗甲素）对鸡特异性免疫和非特异性免疫功能都有一定的促进作用，一方面可以激活机体的体液免疫功能，同时也可提高机体的细胞免疫活性。并对肠道致病菌有一定的清除作用和促进动物增重。
关键词：多抗甲素；鸡；体液免疫；细胞免疫；巨噬细胞；增重
目录
第一章生物活性多糖免疫作研究进展……………………1
§1.1免疫活性多糖的免疫调节作用及其机制…………2
§1.1.1免疫活性多糖的免疫活性研究…………………2
§1.1.2生物活性多糖在临床上的应用…………………9
§1.1.3生物活性多糖在兽医临床上的应用前景…… 10
§1.2免疫增强剂多抗甲素的研究与应用……………12
§1.2.1多抗甲素的发现………………………… 12
§1.2.2多抗甲素对病原菌的抑制和对有益菌的促进作用………12
§1.2.3多抗甲素的免疫调节作用……………………13
第二章增益素（多抗甲素）对疫苗免疫后鸡免疫功能的影响……………21
§2.1材料……………………………………………22
§2.2方法……………………………………………24
§2.3结果……………………………………………26
§2.4讨论……………………………………………29
第三章增益素（多抗甲素）对肉鸡抗大肠埃希氏菌感染和增重的作用……………31
§3.1材料……………………………………31
§3.2方法………………………………………………32
§3.3结果………………………………………33
§3.4讨论……………………………………………35
结论……………………………………………………36
致谢……………………………………………………37
参考文献………………………………………………38
作者简介………………………………………………47
第一章生物活性多糖免疫作用的研究进展
多糖（Polysaccharides）又称多聚糖，是在动物、植物和微生物等生物体内普遍存在的一类种类繁多、结构复杂、具有特殊生物活性的高分子化合物，不仅参与组织细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。糖以多糖或寡糖的形式参与生命过程，而且还与蛋白质、肽及脂质等组成络合物的形式，如糖蛋白、脂多糖等，在生理机能的平衡与稳定过程中发挥重要的调节作用（如细胞的识别、分泌以及蛋白质的加工和转移等方面）。自20世纪50年代末，人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，多糖的研究受到越来越广泛的重视。近20年来，由于生物学、化学等学科的飞速发展，人们对多糖及其复合物的活性作用有了越来越深入的认识。各国学者从各种生物体内提取研究了大量活性多糖，研究结果集中阐述了其免疫调节及抗肿瘤作用，此外还有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等一系列作用。在临床上已用于治疗肝炎、爱滋病、癌症和许多其他疾病。
到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从植物，尤其对从中草药中提取的水溶性多糖研究较多[34]，如对黄芪多糖、灵芝多糖、银杏外种皮多糖、通草多糖、淫羊藿多糖、玉米花粉多糖、银耳多糖、香菇多糖、仙茅多糖、红景天多糖、芦荟多糖等的生物活性多糖的化学结构、药理学特性及免疫学机理等方面都进行了较为深入的研究。微生物类多糖也是一类重要的生物活性多糖，其也具有广泛的生物活性，如链球菌多糖（多抗甲素，PAA）、啤酒酵母多糖、猴头菌丝体多糖、893真菌多糖、868细菌多糖等。
近年来，通过对多糖类物质在药理学与免疫学上深入的研究，认为其属于多功能免疫增强物质，对机体特异性免疫与非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫都有影响。对其免疫增强作用机理的研究也深入到分子、受体水平。
免疫增强剂是指通过非特异途径提高机体对抗原产生特异性产物，并改善机体免疫应答的物质。关于免疫增强剂的作用机理曾提出过许多理论，经过广泛和深入的研究，现在普遍认为，无论是天然的还是合成的物质，都是通过作用于淋巴细胞膜受体，提高细胞中环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的水平，即竞争性抑制cGMP降解酶-磷酸二脂酶而起到免疫增强作用[35]。
§1.1免疫活性多糖的免疫调节作用及机制研究
免疫药理作用的基础是药物对细胞间相互作用的影响。对多糖等天然药物有效成分免疫药理作用方面的研究已进行了多年，发现了一些在体内外都具有明显免疫调节作用的药物，并对其在调控机体免疫系统作用方面也进行了广泛、深入的研究。现在一般认为，多糖对机体特异性免疫与非特异性免疫，细胞免疫与体液免疫皆有影响，但它主要影响机体的网状内皮系统（RES）、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞、NK细胞和补体系统以及RNA，DNA，蛋白质的合成与体内cAMP与cGMP的含量等。其结果是抗体的生成，淋巴因子及干扰素的诱生增多[38，39，40]。
§1.1.1免疫活性多糖的免疫活性研究
§1.1.1.1多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响
单核巨噬细胞是一种重要的非特异性免疫细胞，在机体非特异免疫中发挥着重要作用，是机体防御功能的重要组成部分，它具有强大的吞噬作用，能消灭病原体，消除异物，清除体内衰老死亡细胞以及吞噬抗原等；它还有细胞毒作用，能够靠近靶细胞，使靶细胞表面的抗体Fc段与其Fc受体结合,使其产生多种活性物质，这些物质对感染病原体的细胞、肿瘤细胞、异型或变形的细胞都有强大的杀伤作用；同时巨噬细胞还有提呈抗原的作用，识别和处理抗原物质，将抗原信息传递给T细胞或B细胞；在免疫过程中，巨噬细胞还能释放细胞因子，影响T细胞和B细胞功能。巨噬细胞通常是在抗原与B细胞和T细胞发生免疫应答之前就与抗原发生反应，协助和增强机体免疫应答能力，因此巨噬细胞的吞噬能力是反映机体免疫水平的重要指标之一。
研究表明，黄芪多糖是鸡体单核－巨噬细胞系统的有效激活剂，黄芪多糖和红芪多糖[27]、党参花粉多糖[28]、商陆多糖[29，30]、猪苓多糖[31]、红毛五加刺多糖[32]等都能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞功能，增加小鼠腹腔巨噬细胞计数及炭粒廓清速度，对抗环磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）或氢化可的松（Hydrocortisone，HC）对正常小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用。猪苓多糖[37]能直接增强人体单核－巨噬细胞系统的吞噬能力，减轻药物的不良反应，提高抗菌效果。柴胡多糖能显著增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分数或指数，柴胡多糖注射液可增加肝Kuffer氏细胞吞噬功能。云芝多糖能使小鼠腹腔巨噬细胞乙酰低密度脂蛋白（LDL）受体数目增加，对乙酰LDL的结合、内移和降解提高，具有浓度量效关系[28，29，32，68]。
§1.1.1.2多糖对体液免疫的影响
体液免疫是机体抗御传染的主要因素之一。特异类型B细胞在特异类型抗原作用下合成蛋白质分子并分泌到体液中发生免疫作用，它们或者通过激活补体系统引起免疫溶解作用，或者增强吞噬细胞吞噬和杀灭病原体的能力，或者中和外毒素或病毒等，以抵抗和清除相应的病原微生物或其毒素的有害作用。许多多糖具有增强特异性和非特异性体液免疫功能的作用。周勇[35]等发现仙茅多糖对无胸腺又无T细胞仅有B细胞小鼠（裸鼠）在体外对其脾淋巴细胞有一定的刺激作用，说明其对B淋巴细胞有刺激增殖作用。黄芪多糖（APS）、党参多糖（GPS）、人参多糖（GPS）三种多糖对正常豚鼠无影响，而对经眼镜蛇、蛇毒因子（CVF）处理后的补体下降、吞噬率下降的豚鼠有促进补体恢复的功能，促进中性白细胞吞噬率提高和恢复[41]。
人参多糖对机体特异性免疫与非特异性免疫，体液免疫都有影响，口服人参多糖可使羊红细胞免疫小鼠的B细胞增加，血清中特异性抗体及IgG显著增加，使血清补体显著增加。研究发现红芪多糖（RHPS）和黄芪多糖（APS）对强的松龙(Prednisoline,PDS)与环磷酰胺所致的血清凝集素，溶血素抗体产生受抑制有明显的拮抗作用，并且APS对纠正PDS所致的免疫抑制作用呈量效关系，而RHPS小剂量即可完全纠正PDS的抑制作用，故RHPS的免疫调节作用比APS强，但对CY所致的免疫抑制作用，二者均只能纠正小剂量的CY的免疫抑制作用[27]。Obaid[18]报道，用葡聚糖作为佐剂，给仓鼠免疫接种利什曼原虫，可以显著提高抗体滴度和对利什曼原虫的抵抗力。Benda[1]等在猪上试验发现啤酒酵母多糖可以明显促进抗小牛血清白蛋白抗体的产生，同时酵母多糖也可以促进绵羊血清中人白蛋白（HAS）抗体水平。Chinnah[2]等将芦荟多糖与ND-IBD-IB（鸡新城疫－法氏囊病－传染性支气管炎）三联疫苗合用，发现芦荟多糖能显著提高抗NDV抗体滴度，IBDV抗体存留时间显著延长。杨晓林[42]等报道，褐藻糖胶是小鼠B细胞的有丝分裂原，具有多克隆激活B细胞增殖的作用，而对T细胞没有诱导增殖作用。地黄低聚糖20～40mg﹒kg-1可增强正常、CY抑制及S180荷瘤小鼠脾细胞抗体生成反应能力。郑永标[43]等将868细菌多糖类提取物（按浓度40mg/mL）作为甲鱼免疫增强剂，发现868细菌多糖类提取物具有促进甲鱼抗体产生的作用。
§1.1.1.3多糖对细胞免疫的影响
细胞免疫亦称细胞介导免疫，是指致敏淋巴细胞与相应抗原作用后所导致的特异性免疫。致敏的T淋巴细胞再次受到相应抗原刺激时，可产生和释放出多种大分子免疫活性物质-淋巴因子，发挥细胞免疫功能。Kim[13]报道，蘑菇多糖能促进体外T淋巴细胞的转化率，并增强NK细胞活性。女贞子多糖对正常小鼠和脾阴虚小鼠的脾淋巴细胞增殖都有显著的增强作用[48]。林志彬[44]等报道，灵芝多糖不仅能增强正常小鼠的细胞免疫反应，还能拮抗免疫抑制药物、抗肿瘤药物，以及应激和衰老所致的免疫功能低下，使之恢复到接近正常水平。对其作用机制的研究表明，灵芝多糖可通过间接激活淋巴细胞中DNA多聚酶而促进DNA合成及T细胞增殖，促进IL-2产生，从而影响T细胞亚群的数量和功能[14]。黄芪多糖对雏鸡体外周血T淋巴细胞转化率有增强作用，且与剂量呈正相关。黄芪多糖可以显著提高雏鸡外周血自然杀伤（NK）细胞的活力，这都是因为黄芪多糖不但提供给细胞增殖的能量，而且能促进T淋巴细胞增殖时DNA的合成[45]。李繁[46]等研究表明，注射黄芪多糖能显著提高球虫免疫鸡的淋巴细胞转化水平和E-玫瑰花环形成率，黄会玲[47]等（1997）研究表明，黄芪多糖对鸡T淋巴细胞E-玫瑰花环形成率具有显著影响（p﹤0.05）。耿长山[49]报道，给去胸腺和经抗胸腺细胞血清处理的小鼠（Tx－ATS）口服黄芪多糖，使脾重明显降低，增强正常小鼠对绵羊红细胞（SRBC）诱导的抗体生成反应，但对Tx－ATS小鼠无作用；黄芪多糖虽然能提高Tx－ATS小鼠对细菌脂多糖（LPS）诱导的抗体生成作用，但其作用较SRBC诱导的正常小鼠抗体生成反应作用明显减弱，表明黄芪多糖的免疫增强作用是通过增强T细胞功能而发挥的。商陆多糖（PAP）-1在体外能显著提高小鼠脾淋巴细胞增殖，促进丝裂原刀豆素A(ConA)和LPS诱导的淋巴细胞转化及双向混合淋巴细胞反应，使小鼠外周血白细胞数显著增加，能拮抗CY的降蛋白作用[29，30，50]。PAP-2在31～500μg.mL-1
范围内显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖；在31～125μg.mL-1范围内可剂量依赖地促进ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖，但随着PAP-2剂量增大，对丝裂原诱导的淋巴细胞增殖反应呈抑制作用[51]。猪苓多糖能明显促进小鼠脾细胞对ConA和LPS的增殖反应，增强小鼠特异性抗体分泌细胞数及脾细胞毒T细胞对靶细胞的杀伤活性[52]。仙茅多糖体外单独能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，而单独对小鼠胸腺细胞无作用，但在ConA存在条件下对胸腺细胞增殖有协同作用，体外对尼龙毛柱分离小鼠脾T细胞富含部分有明显刺激增殖作用；体外能对抗由氢化可的松抑制conA诱导脾T细胞增殖，体内对氢化可的松诱导免疫受抑制小鼠胸
腺及脾脏重量降低，胸腺细胞及脾T、B细胞增殖降低有明显对抗作用[35]。研究表明，六味地黄汤具有免疫调节作用，其发挥主要免疫调节作用的活性部位为CA4；化学研究表明，其主要由酸性多糖组成[53]。CA4 125mg.kg-1口服给予，可改善ConA诱导的抗快速老化亚系SAMR1（SAM-resistence/1，SAMR1）及快速老化亚系SAMP8（SAM－prone/8，SAMP8）的脾淋巴细胞增殖反应能力，增强正常小鼠脾细胞辅助活性。进一步证明，地黄低聚糖在10～40mg.kg-1可明显增强荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖反应及ConA诱导的增殖反应能力[54]。枸杞多糖（LBP）能显著增强正常小鼠和CY处理鼠的T细胞介导的免疫反应及NK细胞的活性[25]。女贞子多糖（LLPS）对脾淋巴细胞的增殖有很强的刺激作用，不但对脾B细胞具有直接的刺激增殖作用，对脾T细胞也具有一定的刺激增殖作用，并且可以对抗CY50mg.kg-1.ip所造成的荷瘤小鼠S180的淋巴细胞增殖反应的抵制低下作用[55，56]。茯苓多糖，羟乙基茯苓多糖，羟甲基茯苓多糖可不同程度地使T细胞毒性增强，增强动物的细胞免疫反应，羟甲基茯苓多糖在100㎎.mL-1浓度时可促进小鼠NK细胞活性[52]。当归多糖（ASDP）对小鼠脾细胞有明显的促增殖作用，且促进作用与浓度成正相关，使小鼠脾中T细胞亚群会发生改变，即ASPP主要增加L3T4+细胞比例，促进L34+细胞增殖及调节L3T4+与Lyt2+比值都有关系[57]。韩玲报道了香菇多糖具有增强T细胞功能的作用，已作为新的细胞免疫增强剂应用于病毒性肝炎的治疗[58]。
§1.1.1.4多糖对动物细胞因子的影响
细胞因子是强有力的蛋白性调节因子，可以调节免疫反应、炎性反应、组织修复、组织移植反应和造血。在家畜疾病中，许多病原感染后可以引起家畜免疫功能不全或丧失，这些病原包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等。虽然目前对造成免疫抑制的机理尚不完全了解，但研究表明，一些病原所引起的免疫抑制与白细胞介素2（IL-2）等细胞因子分泌水平降低或表达不正常有关。现已发现的细胞因子主要包括白细胞介素类、细胞集落刺激因子、巨噬细胞调节因子、趋化因子和干扰素等。集落刺激因子（CSF）、白细胞介素（IL）类、干扰（IFN）素、趋化因子等淋巴因子与B淋巴细胞、NK细胞等效应细胞表面的受体结合激活细胞内信号转导系统，效应细胞增殖、分化、分泌抗体，引起免疫应答。T、B淋巴细胞等效应细胞分泌的细胞因子也可作用于巨噬细胞等单核吞噬细胞，构成免疫调节网络[59]。研究表明，许多多糖都具有诱生或促诱生IL-1、IL-2、肿瘤坏死因子（TNF）、IFN，CSF等各种细胞因子的作用。杨吉成[60]等（1997）报道，羟甲基茯苓多糖能诱导外周血淋巴细胞（PBL）产生IL-2、TNF、IL-6、IFN-r，促进人类淋巴细胞系高分泌IFN-α，尤其以羟甲基茯苓多糖配合植物血凝素（PHA）或ConA促诱生细胞因子的作用最佳。猪苓多糖协同IL-2促进人体外周血单个核细胞增殖，调节细胞表达IL-2受体和分泌内源性IL-2、淋巴毒素和IFN的水平，并可显著增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF和IL-1的能力[61]。李金锋[62]等研究发现猪苓多糖和香菇多糖在一定浓度范围内与IL-2合用能增加淋巴因子激活的细胞毒性细胞（LAK）细胞活性，降低IL-2用量。人参多糖可使正常小鼠脾细胞的NK活性及ConA刺激后IL-2和IL-1水平明显提高，使荷瘤小鼠的IL-2，IFN-r及NK活性恢复正常。人参多糖与正常小鼠脾细胞共同培养6h，也能明显增高脾细胞的IL-2和IFN-r水平[41]。灵芝多糖具有多种生理、药理作用能显著增强B细胞产生特异性抗体的能力及T细胞产生（经PHA诱导）IFN-r的能力（P<0.05），促进老年小鼠机体免疫细胞DNA多聚酶的活性，继而促进细胞增殖分裂，导致IL-2合成分泌增加，且具有剂量依赖关系[14]。商陆多糖Ⅰ，Ⅱ都可以促进小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2和CSF，商陆多糖Ⅰ还可以促进巨噬细胞分泌IL-1，促进TNF的产生[29，30，51]。Donzis[4]报道，给小鼠口服可溶性酵母多糖能提高其血浆中IL-1含量，皮下、静脉和肌肉注射葡聚糖均可使小鼠血浆和脾脏中IL-1和IL-2水平升高。Tokaunaka[24]报道念珠菌葡聚糖能促进体外小鼠巨噬细胞IL-6和TNF的合成，并有明显的抗肿瘤作用。燕麦葡聚糖可促进体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞IL-1的分泌，同时还能促进脾脏淋巴细胞IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌[7]。王玲[63]报道枸杞多糖在低浓度时对IL-2和IL-3的产生及其受体表达有明显促进作用，高浓度时则呈现不同程度的抑制效应。8301多糖能促进小鼠脾淋巴细胞产生IL-2，增强NK细胞杀伤靶细胞的活性，配合鸡柔嫩艾美耳球虫活卵囊免疫雏鸡，通过血浆cAMP含量和IFN的动态，观察表明，该多糖能升高血浆中的cAMP含量和IFN的效价[64，65，66，67]。
§1.1.1.5多糖对免疫系统信号转导的影响
与神经和内分泌系统一样，在机体免疫系统内，存在着信号转导网络。免疫应答和免疫调控都是免疫系统内各种细胞相互作用的结果，免疫活性细胞之间复杂的相互作用是依靠许多免疫活性分子介导的。在众多的免疫活性分子中，前列腺素（PG）系统，环核苷酸（cAMP、cGMP）系统和可溶性细胞因子在免疫活性细胞的增殖、分化、分泌和各种功能的表达上占有最重要地位[59]。树突状细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞在受到抗原刺激后或吞噬抗原后,产生细胞因子及一氧化氮（NO）等信号分子,通过与效应细胞表面的受体结合而进行细胞间的信息传递,淋巴细胞在受抗原、有丝分裂原或细胞间信号分子等的刺激后,活化细胞膜表面的受体,经Ca2+或cAMP信号转导途径,引起细胞增殖、分化和功能改变,并分泌淋巴因子。环核苷酸cAMP与cGMP作为第二信使调控着免疫活性细胞的功能,cAMP和Ca2+在淋巴细胞和巨噬细胞的增殖过程中处于中心地位,IL-2通过cGMP的作用启动DNA的合成,cAMP呈要参与免疫后应的负反馈机制,但能促进淋巴细胞的分化。
（1）对前列腺素的影响
前列腺素在介导炎症反应和抗感染上有重要作用。有报道指出多糖可以影响淋巴细胞前列腺素的分泌，如葡聚糖衍生的微珠能促进体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞分泌PGE2和IL-1[51]。酵母多糖通过与细胞β-受体结合促进肺巨噬细胞前列腺素的分泌[22]。
（2）对cAMP、cGMP的影响
众多研究表明多糖能够调节淋巴细胞内cAMP、cGMP的含量和相对比值，他们具有相反的生物学作用。CAMP主要参与免疫调控的副反馈机制，作用大都是抑制性的；cGMP主要参与正活化机制，诱导免疫活性细胞的增殖、分泌和活化，作用多属于促进性的。环核苷酸在淋巴细胞分化中超出一般规律，cAMP起促进作用，cGMP反而起抑制作用，淋巴细胞转化与cAMP关系密切。红芪多糖能拮抗强的松龙(PDS)引起免疫抑制，与PDS合用8d,能升高小鼠血浆cAMP水平。枸杞多糖(LBP)在50～400mg.mL-1时可剂量依赖性地升高小鼠淋巴细胞内cAMP和cGMP水平;50mg.mL-1尚可升高PHA活化的脾细胞内cGMP的水平;200mg.mL-1LBP可增加ConA活化的小鼠脾淋巴细胞膜上的蛋白激酶C（PKC）活性;由此表明LBP发挥免疫调节的可能途径是LBP与细胞表面物质相互作用,并能过cAMP/cGMP系统地增PKC活性,促进免疫细胞活化增殖.来发挥广泛的免疫调节效应[68，69]。白润江[70]研究发现香菇多糖能够增加小鼠血浆、脾脏和胸腺中cGMP含量，降低胸腺和脾脏中cAMP含量。李春明[71]发现灵芝多糖能剂量依赖性引起小鼠腹腔巨噬细胞中cAMP浓度快速升高，其作用可能是与受体结合，激活G蛋白，活化腺苷酸环化酶，进而使cAMP浓度升高。
（3）对NO的影响
NO是新发现的一种重要的信使分子，具有广泛的生理作用，除对中枢神经系统和心血管系统有重要作用外，对免疫功能也具有重要调节作用。生理状态的巨噬细胞产生的NO起免疫调节作用，而在一些诱导剂作用后巨噬细胞可产生大量的NO，从而对外源性抗原及肿瘤细胞等起到杀伤作用[72]。多糖影响淋巴细胞尤其是巨噬细胞中NO含量已有不少报道。Nose[17]报道干草多糖能促进体外培养的巨噬细胞分泌NO。侯敢[73]报道猪苓多糖对小鼠巨噬细胞NO的产生具有明显促进作用，这一作用可被RNA转录抑制剂放线菌素D和NO合酶抑制剂所抑制。牛膝多糖（ABPS）在体外可以提高老年小鼠T淋巴细胞的增殖能力和IL-2的分泌；在体内能显著提高老年大鼠T淋巴细胞和血清中TNF-γ或IL-2及NO的产生和一氧化氮合成酶（NOS）的活性，降低其可溶性IL-2受体的产生[74]。香茹多糖或其协同干扰素对小鼠腹腔巨噬细胞NO的生产均有明显促进作用，这一促进作用能被RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂放线菌酮和一氧化氮合酶抑制剂L-NMA所抑制[75]。Hashimoto[9]研究发现葡聚糖能促进NOS基因的表达，使其mRNA转录和蛋白质合成增加，进而促进NO的合成与分泌。
（4）对钙离子传导的影响
钙离子（Ca2+）是一种重要的信使分子，对淋巴细胞功能有重要作用，如调节淋巴细胞的分裂，介导巨噬细胞的吞噬作用等。崔金莺[76]报道，银耳多糖（TP）在一定剂量范围内可以剂量依赖方式增加脾细胞内游离Ca2+，在为零时，TP对内钙释放无影响，钙通道阻断剂（Verapamil 20mg.ml-1）可阻断TP升高脾细胞内游离Ca2+浓度的作用。螺旋藻多糖可剂量依赖性的引起小鼠腹腔巨噬细胞[Ca2+]的明显升高，其升高是胞外钙内流和胞内钙释放共同作用的结果[77]。灵芝多糖也可以通过类似机制引起小鼠T淋巴细胞[Ca2+]升高[78]。Mork[15]研究了多糖影响巨噬细胞[Ca2+]的机制，发现激活葡聚糖受体能激活细胞膜的钙通道引起Ca2+内流，其机制与PKC有关，用calphostin抑制PKC活性，则酵母多糖引起的Ca2+内流显著下降，而PKC激活剂能模仿酵母多糖的作用。Ca2+内流需要细胞外钙的存在，而Ca2+拮抗剂可抑制Ca2+的内流。酵母多糖也可使PKC从细胞质转移到细胞膜，而用Genistein（5,7,45-三羟异黄酮）抑制蛋白质酪氨酸激酶（PTK）阻止了酵母多糖引起的Ca2+
内流和PKC转移。表明PKC的转移依赖于PTK活性。
§1.1.1.6多糖与神经－内分泌－免疫调节（Neuroendocrine immumomodulation，NIM）
网络关系
中医“肾”的概念与现代医学的NIM网络的理论极为相似。近年来，NIM网络学说逐渐渗入到了中药免疫药理学的研究中。下丘脑－垂体－肾上腺轴（HPA）及交感神经激活是应激造成免疫抑制的重要的两条途径。枸杞多糖（LBP）在5～10mg.kg-1剂量范围内通过调节下丘脑去甲肾上腺素（NE）含量及外周免疫器官神经信使水平，使脾脏NE含量下降至正常值的40％～50％，同时LBP还可以影响血浆中皮质酮（Cs）水平，从而发挥LBP的免疫调节作用[79]。提示，活性多糖的免疫调节作用不仅与其直接作用于免疫系统有关，而且还与其调节NIM网络平衡有密切关系。
§1.1.1.7多糖自身性质对其活性的影响
大量研究表明，多糖的生物活性不但与其相对分子量、溶解度、黏度、分子的初级和高级结构有关，而且还与给药途径、给药剂量和实验动物的种系有着密切关系。
（1）多糖中元素含量与免疫的关系
研究表明，人体内必需元素对机体免疫系统、免疫细胞的结构和功能具有调节作用，第一章文献综述生物活性多糖免疫作用的研究进展9可增强机体抗病能力。白润红[80]等报道，机体内Ca2+缺乏，可降低机体免疫功能。当归多糖、党参多糖、香菇多糖均能增加小鼠血液Ca2+的含量，补充机体对Ca2+的需要，保护免疫细胞，使巨噬细胞吞噬功能增强，T细胞的E花环形成和淋巴细胞转化增加，B细胞抗体生成增多等。铜对免疫细胞中线粒体功能具有促进作用，当归多糖、党参多糖、香菇多糖可增加小鼠血清中铜的含量，从而增强了免疫细胞的免疫功能。此外，当归多糖、香菇多糖还可以通过增加小鼠血清中锌和镁的含量来增强机体免疫功能。
（2）多糖结构及相对分子量大小对其活性的影响
多糖相对分子量和糖苷键类型是影响多糖活性的重要因素，Cleary[3]等用不同相对分子量和1，6-糖苷键含量的葡聚糖处理小鼠巨噬细胞，均可促进巨噬细胞活性和NO产生，但相对分子量越大，1，6-糖苷键越多，葡聚糖的作用越强。一般来说，多糖的相对分子量越大，其活性越高。但近年来研究发现某些小分子多糖，如枸杞多糖及寡糖亦有较强的免疫活性。多糖活性还与高级结构有关，Falch[8]研究了裂褶菌多糖、香菇多糖相对分子量和结构与活性的关系，发现具有线形、三螺旋结构、相对分子量大于106的多糖能更有效的刺激单核细胞产生细胞因子，而将多糖用氢氧化钠（NaOH）处理后，破坏其线形结构和三螺旋，则多糖的作用减弱。不同中药多糖有其适宜的给药剂量，增大剂量并不能提高其效价，如超过一定剂量反而会出现效价降低，甚至抑制免疫功能。
§1.1.2生物活性多糖在临床上的应用
多糖是一种具有多方面生物活性的物质，它具有调节动物机体免疫的作用，因此将多糖单独作用或疫苗配合使用，将对疫病起到一定的治疗和预防作用。美国有人曾研究芦荟中提取的乙酰甘露聚糖，发现它很容易被免疫细胞摄入，从而大大增强宿主动物对入侵微生物（如病毒）的免疫应答，将乙酰甘露聚糖与鸡马立克氏病院疫苗合用，免疫力的产生比仅接种马立克氏病疫苗者提早3d；与遗传工程脆弱艾美耳球虫抗原合用，也使鸡的免疫力有稳定一致的提高，将乙酰甘露聚糖注射1月龄雏鸡后再以粗粒气雾对其接种新城疫疫苗，结果使鸡免疫应答增强。孙菲[81]等（1995）研究表明，高山红景天多糖对感染柯萨奇B5病毒（CVB）小鼠的心肌功能和免疫功能提高均具有明显的促进作用，增强了小鼠抗CVB5感染的能力，并对由CBV感染性疾病也有一定的防治作用。方积年[82]和韩玲[58]等分别综述了香菇多糖的研究进展，认为香菇多糖是一种较理想的免疫促进药物，主要用于治疗胃癌、肝癌、肺部及血液系统肿瘤，是一种兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂，国内外临床应用已显示出了较好的疗效，其具10增益素（多抗甲素）对鸡免疫功能和生长性能的影响有增强T淋巴细胞功能的作用，已作为新的细胞免疫增强剂应用于病毒性肝炎的治疗。此外小儿反复呼吸道感染，硬皮病及皮肤病等，香菇多糖也显示出了一定的疗效。施保华[37]等（2000）报道，将猪苓多糖与自身菌苗联合使用，可以提高抗菌效果，对治疗耐药菌株引起的慢性感染呈相加作用。屈洪岩[83，84]等报道，通过花粉多糖对新城疫克隆30弱毒苗的免疫效果的比较发现，5%的玉米花粉多糖具有明显的增强体液免疫和细胞免疫效果，且作用最好，当玉米花粉多糖水溶液与新城疫克隆30弱素苗合用，可使鸡的免疫力产生比仅用克隆30弱毒苗免疫提早3d，并且在疫苗使用半量时，与对照组相比，HI抗体效价平均值均高于对照组（P<0.05或P<0.01），可能是由于多糖改变抗原分子构型或其电荷，从而延长抗原贮存和释放时间，增强抗原性，由此持续地刺激机体而增强特异性免疫应答，从而可以在疫苗使用半量时仍能获得良好的保护作用[85]。另外据报道[86]玉米花粉多糖与ND-EDS（新城疫-产蛋下降综合症）二联油苗或猪瘟疫苗联合使用时，都具有免疫增强作用，对猪瘟的增效作用是低剂量组（30mg）优于高剂量组（90mg），提示玉米花粉多糖对猪瘟疫苗的免疫效果有一定的增强作用，可作为免疫佐剂。程富胜[87]等用8301多糖配合鸡马立克疫苗经不同途径给予试验鸡，通过琼扩实验测其血清抗体效价表明8301多糖肌注对马立克疫苗有明显的增效作用。袁永隆[88]等报道8301多糖可以使禽霍乱菌苗的保护率提高30%左右。
§1.1.3生物活性多糖在兽医临床上的应用前景
生物活性多糖作为一种天然的免疫调节剂，对动物机体的免疫调节作用是多方面的、确实的。由于生物活性多糖存在着普通的免疫调节与促进作用和特殊的组成结构。在生产实践中除了直接或配合疫苗用于预防和治疗疾病外，随着生物学、分子生物学、药理学、免疫学、化学等学科的深入发展，对多糖免疫调节作用的研究将更加深入，其应用也将更加广泛。
§1.1.3.1构建新疫苗
随着畜牧养殖业越来越向工业化生产发展，免疫预防也出现了新的问题，其中选择最佳免疫途径，尽可能地模拟病原体的自然感染途径显得更为重要。最近针对大量的畜禽肠道内感染性疾病而提出的口服黏膜免疫已显示出优势。由于肠道内淋巴细胞比任何其它组器官多，而且肠道接触抗原的表面最大，因此，其可能是最大的抗体制造者。抗原口服后先激活肠道前体细胞，随后在呼吸道、生殖道、乳汁、唾液、泪液中出现特异性分泌型抗体SlgA，其产生量是IgG的两倍，且每天分泌到消化道的IgA比合成及释放到血清中的IgG的总量还要多。以SlgA抗体为特征并与整体相关连的黏膜免疫系统含有特殊的淋巴样组织，环境中的抗原与之接触并被吸收，然后诱生B和T细胞应答，随后特异性淋巴细胞离开并聚居于各种效应部分（如黏膜固有层和腺体）。这些应答由T细胞和细胞因子调节，并导致浆细胞分化和外分泌中产生SlgA抗体，SlgA对微生物粘附于宿主黏膜上皮细胞有直接抑制作用。由于SlgG独特的电荷、广泛糖基化和对蛋白质水解的抵抗，因此它比特异性相同的IgG抗体更有效。
由于生物活性多糖存在着普遍的免疫调节与促进作用和特殊的组成结构，因此，利用多糖的结构组成来构建适宜的疫苗将成为可能（不仅仅作为佐剂）。多糖用于疫苗构建并释放到黏膜诱导处，在发生感染的黏膜表面激发宿主的保护性免疫应答反应，并且使口服免疫多糖具有以下特点：（1）毒副作用小、不良反应少；（2）增加安全性，因为通过口服途径的细菌污染物反应原性低于胃肠道途径；（3）提纯费用较低，可补偿口服所需抗原量增多而增加的费用。
§1.1.3.2研制新药物
多糖可经过浓硫酸法、三氧化硫—吡啶法、氯磺酸—吡啶法和三氧化硫—二甲酰胺法等4种方法硫酸化而形成多糖硫酸酯，其对病毒有明显的抑制作用。硫酸基团是抗病毒的一个先决条件，如葡聚糖本身不具有抗病毒活性，但硫酸葡聚糖则具有抗人类免疫缺陷病毒（HIV）活性。再如，香菇多糖硫酸化后形成香菇多糖硫酸酯，其抗HIV的活性增强。牛膝多糖硫酸化后可明显抑制乙型肝炎病毒HBA和HBA的活性，对I型单纯性疱疹病毒有明显的抑制力[89]。从夏枯草中分离的硫酸化多糖对HIV有抑制作用。硫酸细菌糖胺聚糖对HIV有体外抑制活性，它阻止合细胞的形成，阻断病毒对宿主细胞的吸附等。
另外，病毒为了繁殖，需要最佳浓度的铁和锌，这些金属对于大量的酶反应是必需的，直接增加或减少这些物质浓度，则病毒的生长可以受到限制。已知镍与钴不足，可加剧锌的缺乏，提高铁的浓度，可抑制钴的吸收。根据这个揭示，我们可以将多糖作为配体与铁发生络合反应，成一种以铁离子为中心的络合物，作用于病毒，夺走锌离子，从面抑制核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，相应地抑制病毒DNA的合成，达到抑制病毒的作用。
多糖还可用作缓释制剂的新辅料。药用辅料在相当程度上决定新剂型和新剂的质量，而多糖不仅具有抗炎、抗病毒、抗癌的作用，而且可以增强机体的非特异性或特异性免疫功能，保护细胞损伤等功能。利用多糖作为辅料不仅具有控释制剂的一般优点而且因其对免疫功能的调节作用，可以大大地提高药物的疗效[90，91]。
§1.2免疫增强剂多抗甲素的研究与应用
免疫增强剂（mmuno-stimulator）是单独使用即能引起机体出现短暂的免疫增强的物质，按性质可分为生物免疫增强剂、细菌免疫增强剂、化学免疫增强剂、中草药免疫增强剂等。PAA是一种生物免疫增强剂，是具有多种生物活性的生物反应调节剂。
§1.2.1多抗甲素的发现
多抗甲素（PolyactinA，PAA）是从健康人口腔分离的一株α溶血性链球菌33#菌株经深层培养，提取精制所得的一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的多糖类物质，化学分析为α-甘露聚糖肽物质，属于一种糖蛋白，是我国首创的一种新型免疫增强剂。它是由西安医科大学方亮教授在克山病的研究中发现的，于1976年从链球菌的代谢产物中提取的多糖类物质，初步试验有抗肿瘤作用，临床预试有一定效果。1976年国家医药管理局安排四川抗菌素工业研究所，在方亮教授的指导下和初步工作的基础上，开展了菌种筛选，获得了多抗甲素产生菌33#菌株，并对菌种生理生化特性、血清型分类、深层培养和提取工艺、理化特性、化学组成、毒性和药理用量标准等方面进行了系统的研试。多抗甲素糖含量为87.7%～90.3%。主要为甘露糖；氨基酸总量为4.5～6.2%，主要为苏氨酸，丝氨酸、天门冬氨酸等十几种，平均分子量为7万左右。1984年，西安光华制药厂完成国内首个多抗甲素（α-甘露聚糖肽）口服液工业化生产，有关其临床应用和药理学研究也已取得重大突破。研究表明PAA在动物水平和细胞水平上均可以起到抑制肿瘤生长和促进免疫系统的作用，尤其在免疫系统方面，PAA在一定剂量内可以增强吞噬细胞、NK细胞、K细胞和LAK细胞发挥其免疫功能，可以增强体液免疫应答和免疫记忆功能，如提高抗体和补体表达量等，以及可以提高小鼠体内和体外IL-1的产生和分泌水平[11，12，92，93]。PAA还能影响骨髓造血干细胞，有刺激造血的作用，对保存中的血小板有保护作用，对血小板表面活性与聚集性有良好影响，山莨菪碱对PAA的上述功能有协同作用[94]。
另外，PAA在结构上属于一种甘露聚糖肽，当其进入动物消化道后，会被消化酶分解为甘露聚糖（低聚甘露糖）和碱性多肽两部分，而甘露聚糖经相应酶的不完全水解产生甘露寡糖（MOS），通过这几种生物活性物质来发挥重要的作用。
§1.2.2多抗甲素对病原菌的抑制和对有益菌的促进作用
研究表明，甘露聚糖对病原菌具有一定的吸附作用，当将大肠杆菌或沙门氏菌与低聚甘露糖一起培养时发现有凝集现象，可以干扰肠道病原菌的定植，从而打断了病原菌附着－繁殖－致病的途径，并携带病原菌排出体外。主要原因在于寡聚糖可以和病原菌产生的外源凝集素结合，防止微生物在胃肠道上皮的附着。凝集素与糖分子的结合具有高度的特异性[95，96]。1989年Oyofo等给鸡饲喂阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖后，沙门氏菌在鸡肠道上皮的吸附量分别为对照组的18％、39％和11％，表明甘露糖的效果优于其他糖。
PAA可以为肠道有益菌提供营养，甘露寡糖（MOS）因其特有的糖苷键（α-1，4糖苷键）不能被动物消化酶利用，肠道内的有益菌（双歧杆菌和乳酸菌）却能很好的利用MOS而能大量繁殖；相反，大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌则不能利用MOS，使其饥饿而死。另外，Yasuis（1992）试验证实，某些双歧杆菌可以诱导免疫球蛋白A的分泌。
PAA对霉菌毒素具有结合作用。霉菌毒素是由需氧菌产生，是动物营养的最大挑战之一，而酯代葡甘露聚糖（Esterified glucomannas）是一种较好的霉菌毒素结合剂。Diaz（1999）在奶牛精料混合物中添加500g/t的甘露聚糖可以使奶中的黄曲霉毒素水平下降，从而减少霉菌毒素对人和动物的毒副作用，降低霉菌毒素的免疫抑制作用[97，98]。
PAA还可加强机体对营养物质的消化吸收。MOS通过发酵产生短链脂肪酸，降低pH值，抑制有害菌的生长，同时也刺激消化道的蠕动，而且通过微生物区系的改变而改变肠道形态（肠绒毛高度、腺窝深度），更加有利于营养物质的消化吸收[97]。Newman等（1993）报道，在1～35日龄的犊牛的奶中添加MOS时，生长速度提高8％，采食量提高10％[99]。
肽不仅是机体蛋白质代谢的底物，而且还具有其他重要的生物学作用。碱性多肽能作用于革兰氏阳性菌的细胞成分－聚肽糖，切断连接N－乙酰葡胺和N－乙酰胞壁酸的聚糖链，丧失其坚韧性，细菌发生低渗透型裂解，从而杀伤细菌[100]。肽还有促进巨噬细胞的吞噬作用，促进淋巴细胞和脾细胞的增殖作用，从而增强机体免疫力。
§1.2.3多抗甲素的免疫调节作用
PAA作为一种多糖类免疫调节剂，其对机体的免疫调节作用及其机理都进行较深入的研究，在人医临床上主要用于多种肿瘤的辅助治疗，研究表明其具有增强抗肿瘤药物疗效和增强机体免疫系统功能的作用。能提高外周血白细胞，活化单核-巨噬细胞系统吞噬细胞的功能，对抗免疫抑制剂对免疫力功能的抑制作用，活化淋巴细胞和网状细胞，诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质，并能改善和增强机体的应激机能，具有抗炎作用。
§1.2.3.1多抗甲素对巨噬细胞功能的影响
巨噬细胞在免疫反应中有多种重要的功能，是机体防御功能的重要组成部分，具有吞噬杀菌的细胞作用，所以被认为是机体对外界微生物侵入和限制恶性细胞生长的第一道重要防线。正常巨噬细胞表面带有IgG Fc受体和补体C13受体，故能吞噬抗原抗体复合物和抗原抗体补体复合物。巨噬细胞的细胞杀伤性是由接触性或非接触性2种方式进行的，其细胞杀伤作用机制包括：（1）巨噬细胞对靶细胞的吞噬；（2）巨噬细胞释放细胞物质，如离子氧、干扰素-γ及肿瘤坏死因子（TNF），因此巨噬细胞的吞噬能力是反映机体免疫水平的重要指标之一。PAA是一种免疫增强剂，其作用机制主要是通过免疫途径来实现的。因而有关他对巨噬细胞功能影响的研究报道比较多。
胡其乐[101]等（1991）发现PAA能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1，这一活性与LPS的作用有相加的作用，PAA无论在体内或体外其诱导IL-1分泌的作用比诱导IL-1合成作用强，PAA在体内拮抗环磷酰胺（Cy）对淋巴细胞表达IL-1受体及其对IL-1反应性的抑制作用。研究还表明PAA能直接诱导人单核细胞生成IL-1，也能与大肠杆菌脂多糖协同作用刺激IL-1生成。
刘晓波[102]（1994）研究表明，PAA能显著增强在淀粉或硫代乙醇酸钠（TG）刺激下获得免疫应答能力而表达吞噬功能的小鼠巨噬细胞的吞噬功能，细胞毒作用，IL-1及TNF的分泌功能（P<0.05），且呈良好剂量依赖关系（0.5mg.L－1），对于休止态小鼠巨噬细胞无明显直接促吞噬作用这与甲硫脑啡呔作用相似。
由于成熟巨噬细胞的活化过程可分为3个阶段：应答阶段、激发阶段、触发阶段，所以PAA表现出来的这一特性可能是因为淀粉或硫代乙醇酸钠使休止态的巨噬细胞转变应答态的巨噬细胞，从而获得了表达白介素-2受体（IL-2R）并与IL-2发生反应的能力。在不同浓度PAA激发下巨噬细胞表面IL-2R表达进一步增强，同时对IL-2的反应性也得到增强，可结合更多的IL-2，增加了H2O2的产生与释放，同时促使巨噬细胞释放更多的细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、IL-1等。TNF和IL-1在许多方面具有相似的功能，如诱导T细胞和B细胞的功能活化，增强丝裂原反应，增加NK细胞功能活性，因而表现出显著的抗肿瘤作用[103,104]。这与目前了解的多糖类药物对活性细胞因子的产生和诱导作用是基本相符的。
董晓慧[105]等（1995）研究PAA对S180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的作用，发现PAA能促进巨噬细胞向单一炎症局部趋化和积聚，同时形态学及研究发现，PAA组鸡腹腔细胞中体积增大和黏附力强的细胞数明显多于生理盐水组；另外，其吞噬能力及产生TNF-α能力也相应增强，提示巨噬细胞可能通过细胞－细胞间的直接杀伤及释放TNF-α等细胞因子，进而杀伤靶细胞的双重途径而发挥其抗肿瘤作用。
马布仁[103]等（1995）研究发现经淀粉刺激后的小鼠巨噬细胞加入PAA后，分泌IL-1、TNF的功能显著增强，呈良好的剂量依赖特征，PAA能促进巨噬细胞表达IL-2R，在PAA浓度为0～5μg.ml-1范围内，上清液IL-2活性明显降低，增强巨噬细胞与IL-2的反应性。
刘小康[106]等（2000）发现PAA对小鼠巨噬细胞NO的释放有促进作用，同时可在体外过过NO直接杀伤肿瘤细胞。PAA便是这样的一种诱导剂，它可以提高NOS的活性，使巨噬细胞产生的NO量明显高于正常值，但其效果不如肉毒素强，当加入NOS抑制剂后，NO的含量均低于原来的1／3，可见，PAA可能是通过促进NO产生而发挥抗肿瘤作用的，但这仍有待于进一步证实。
以上研究表明PAA可以在体内或体外促进巨噬细胞的吞噬活性，增加分泌淋巴因子的量，发挥调节机体免疫功能的作用。
§1.2.3.2多抗甲素对人淋巴细胞的影响
PAA对淋巴细胞的影响，主要是通过刺激淋巴细胞的分化、分裂、增殖、提高淋巴细胞转化率和增强淋巴因子的分泌。对人淋巴细胞免疫功能的影响，目前主要采用3H—胸苷和14C－尿苷参入法研究PAA对于淋巴细胞免疫功能的影响，通过观察PAA在培养中对淋巴细胞DNA和RNA合成能力的影响，来了解淋巴细胞的免疫功能状态及在肿瘤治疗中的作用。DNA合成是细胞分裂繁殖的物质基础，RNA以DNA为模板转录合成，在正常情况下，实验证明肿瘤病人的淋巴细胞DNA及RNA合成功能明显低于正常人。在应用PAA治疗后，细胞免疫功能迅速改善，3H-胸苷及14C-尿苷的参入计数明显高于治疗前，表明PAA改善和调节了肿瘤病人淋巴细胞的免疫功能[107]。胡其乐[108]等（1990）发现，PAA在0.01～100μg.ml-1的浓度范围内能显著提高人淋巴细胞在PHA作用下对IL-2发生反应的能力，此作用呈剂量依赖性。PAA在低浓度（0.01～0.1μg.ml-1）时，尚能拮抗正常人血清中IL-2抑制物的活性，提示PAA能促进IL-2的生成和反应性，从而增强细胞免疫功能。李剑[109]等（1992）研究表明，PAA具有较广泛的免疫增强作用，其抗瘤作用与其增强荷瘤小鼠细胞免疫功能有关。
强文安等（1994）应用3H-TdR参入法研究PAA对人的淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性的影响，结果表明100mg.mL-1.PAA对正常人和食道癌患者外周血淋巴细胞增殖有直接刺激作用。在有细胞分裂剂PHA作用下，PAA能促进正常人和食道癌患者PBL增殖反应的浓度分别为100～1000μg.mL-1和10～1000μg.mL-1，提示PAA有免疫调整作用，另外，食道癌患者外周血淋巴细胞的NK细胞活性明显低于正常人[110]。用同位素参入法测定PAA对正常及荷瘤小鼠细胞有促增殖作用，并使小鼠脾细胞对PHA刺激的反应性不因荷瘤而降低，PAA且能增强正常及荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性，拮抗Cy对NK活性的抑制作用，PAA在体外能不同程度地抑制B16-F10黑色素瘤细胞DNA，RNA的蛋白质合成[111]。应用放射性同位素前体参入法研究了PAA对人慢性髓性白血病细胞标K562，人早幼粒白血病细胞株HL-60，鼠×鼠杂交瘤细胞株E4B11C9和小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的DNA、RNA和蛋白质分成作用的影响，发现10～5000μg.mL-1的PAA体外对四株肿瘤细胞的DNA，RNA和蛋白质合成均有不同程度的抑制作用，并存在明显的剂量依赖性和瘤株差异性，在大剂量时对RNA的抑制作用最强。对肿瘤细胞DNA合成的抑制作用有明显的瘤差异性，对K562细胞作用最强，B16-F10、E4B11C9次之，HL-60较弱。PAA对四株肿瘤细胞RNA合成小剂量无明显影响，而大剂量（100～5000μg mL-1）则抑制非常显著（P<0.01），大剂量PAA对四株肿瘤细胞蛋白质合成有一定抑制作用，其中对E4B11C9抑制作用最强，K562，B16-F10次之，HL-60较弱[112]。王玉明[93]等（1993）发现PAA能抑制T-56细胞的RNA合成，但对其并无致死效应，从而证明PAA所导致的生长抑制及RNA合成降低是发生在活细胞内的反应。
体外研究发现，用PAA共育外周血单个核细胞可增强其NK细胞活性和巨噬细胞的细胞毒性，但对T细胞的特异性和非特异性细胞毒性并无影响[113]。最近的研究发现用多抗乙素(由乙型链球菌深层发酵培养、提取获得)治疗S180荷瘤小鼠后，其肿瘤特异性细胞毒性可明显增强，尤其是经治疗后瘤体增长最慢，对肿瘤体积较小的治疗组更为明显。而对NK细胞敏感细胞株K562的杀伤活性则无明显的增强。这可能是由于多抗乙素增强了荷瘤小鼠的细胞免疫而使肿瘤生长缓慢所致[114]。有关特异性细胞毒T细胞的活化可能来自于巨噬细胞和NK细胞产生的IL-l、IFN、TNF等细胞活性物质或细胞间的直接作用；这些细胞活化后，其抑制和杀伤肿瘤作用可进一步放大增强。在正常情况下，淋巴细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用，当细胞免疫功能降低至不能抑制肿瘤细胞突变时，就可能发生癌变。测定肿瘤病人淋巴细胞免疫功能，对评估机体免疫功能评价疗效等均有重要意义。
§1.2.3.3多抗甲素抗肿瘤作用
PAA自从其发现开始，主要用于治疗人肿瘤疾病，单独使用或配合放、化疗使用，PAA能提高近期疗效，提升外周血白细胞、增加淋巴细胞、免疫球蛋白和补体，增强和调节机体免疫功能等作用。研究发现PAA抗肿瘤作用，一方面是作用一种抗原性物质，通过增强机体免疫功能，发挥机体自身防御机能的作用，抑制消灭肿瘤（癌）细胞；另一方面是PAA直接作用于肿瘤细胞，通过其化学物质—糖蛋白来抑制肿瘤细胞DNA复制，从而影响其蛋白质合成，而达到抑制肿瘤作用，但对正常细胞则没有损害作用。徐远义[119]等研究发现，给大鼠腹腔内分别注射不同剂量的PAA，2d后检测发现，巨噬细胞数量、乳酸脱氢酶（LDH）和酸性磷酸酶（ACP）的活性、NO的分泌以及细胞杀伤性都随着PAA剂量的增加而增强，说明PAA通过三种方式增加腹腔巨噬细胞杀伤癌细胞作用。①诱导大量的巨噬细胞进入腹腔，②增强这些细胞的吞噬、清除能力，③增强巨噬细胞的非接触型细胞杀伤性。
(1)对人天然杀伤细胞活性的作用
NK细胞在体内可抑制肿瘤的发生、发展和转移，是机体执行免疫监视功能的重要效应细胞。恶性肿瘤患者NK细胞的活性降低可能是肿瘤发生和发展的重要因素之一。胡其乐[101]等（1991）发现PAA影响单核细胞调节NK细胞活性的作用与其浓度密切相关，较低浓度PAA预处理后，单核细胞抑制NK活性，高浓度PAA处理后，单核细胞则促进NK活性。强文安[115]等（1994）研究了PAA对人体NK细胞活性的作用机理。结果表明PAA能增强食管癌患者淋巴细胞（PBL）明显低下的结合率（B%）和杀伤率（K%）；也可增强正常人PBL的K%但对正常人PBL的B%无影响。形态学观察发现，与靶细胞结合的淋巴细胞除大颗粒淋巴细胞外，尚有普通的非颗粒淋巴细胞，结合的靶细胞损伤首先表现为线粒体肿胀、空泡变化，然后核固缩，核膜损伤，细胞严重空泡变性等，偶见靶细胞与自然杀伤细胞结合部质膜破损的现象。经PAA预处理的靶效细胞结合的形态改变无明显差异，但食道癌组的杀伤作用出现较早，且明显增强。PAA能增加人外周血淋巴细胞内IL-2的生长和适应性
[23]，而IL-2[6]和IFN[108]又能通过直接激活与靶细胞结合。但IL-2和IFN均不能杀死靶细胞的“前NK细胞”，而使之成为具有杀伤能力的活性NK细胞来实现其增强作用。故推测PAA可能是通过直接激活“前NK细胞”或(和)促进IL-2的生成来提高NK细胞的活性的[115]。另外还发现PAA对NK细胞活性的增强作用表现为时间和剂量依赖性[110]，提示临床治疗中，应综合考虑选择时间和剂量的最佳方案。
NK细胞－靶细胞的识别和结合是杀伤的必要前提，有结合才有可能导致杀伤。形态学观察发现：效应细胞可伸出突起插入靶细胞内，或通过胞膜而紧密接触，有时甚至从两极进入靶细胞，此种现象可能与NK细胞杀伤作用有某种关系。经PAA预处理的效应细胞似无促进NK细胞与靶细胞的结合，但可能促进了未成熟NK细胞释放淋巴细胞颗粒或某种可溶性细胞溶解因子[26]，使靶细胞遭受致死性损伤，导致溶解。在NK细胞杀伤机制中，效靶细胞结合过程中形成的机械损伤也可能存在。食道癌患者中NK细胞与靶细胞结合和被杀伤的靶细胞的形态学改变，与正常人相似[115]。有关PAA影响NK细胞杀伤过程的作用机制需要进一步探讨和研究。有学者认为体外测定NK细胞的活性，对选择治疗方案，判断预后有指导作用，尤其是应用生物反应调节剂治疗肿瘤病人时，NK细胞活性测定可用来判断药物的治疗效果[110]。
(2)对淋巴因子激活的细胞毒性细胞(LAK)增殖抑制及杀伤活性的影响
淋巴因子激活的细胞毒性细胞(LAK)细胞在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过程中具有重要的应用，LAK／IL-2疗法是一种有效的肿瘤生物治疗方法，对某些类型的肿瘤有良好的疗效[20]，但是需要相当数量的效应细胞辅以大剂量的IL-2，代价昂贵，不良反应大，因而其推广受到限制[116]。一些生物反应调节剂（Biological response modifier，MRN）能增强LAK活性，降低IL-2用量，其本身的不良反应又较小，因此采用生物反应调节剂是改进LAK／IL-2疗法的有效措施之一。PAA便是一种新型的生物反应调节剂，能够提高LAK活性、降低IL-2用量，因而可用于改进肿瘤的LAK／IL-2治疗。有研究表明，PAA能增强人外周血淋巴细胞表面IL-2R的表达，促进人外周血淋巴细胞在植物凝聚素作用下分泌IL-2，增强IL-2发生反应的能力以及增殖能力。由于LAK细胞为IL-2激活的淋巴细胞，因此，PAA对LAK的作用机制类似于PAA对外周血淋巴细胞的作用。PAA作用于LAK细胞，使LAK细胞表面IL-2R的表达增强，LAK能结合更多的IL-2，其增殖反应、杀瘤作用就得到进一步增强。刘小波[117]等（1996）研究了PAA对小鼠LAK细胞活性的影响，在亚适剂量IL-2（200μg.mL-1）和不同浓度PAA共同诱导脾淋巴细胞，PAA能明显增加淋巴细胞的增殖反应且呈剂量依赖性，PAA在较高浓度时，能明显增强LAK细胞杀伤S180细胞作用，无论在高低浓度时都能明显增强LAK细胞杀伤K562细胞（红白血病细胞株）的作用。1997[118]年发现PAA单独对静止淋巴细胞增殖反应无作用，也不能诱导出LAK活性，但能显著增加IL-2诱导的淋巴增殖反应，杀瘤活性及其表面IL-2R表达。当浓度为10μg.mL-1的PAA与低剂量200μg.mL-1IL-2联合应用时，诱导出的LAK活性强度相当于浓度为1000μg.mL-1IL-2水平，从而提出，PAA与IL-2合用能共同诱导LAK的活性，降低IL-2用量，由于PAA成本相对较低，又无明显不良反应，本身又是一种生物反应调节剂，因此临床上可望将PAA与LAK／IL-2疗法联合应用，以降低IL-2的服用量并减少其不良反应。
§1.2.3.4多抗甲素对动物红细胞变形能力和免疫功能的影响
正常的红细胞有很好的变形能力，通过变形,红细胞可穿过直径3～5μm的管道，在微循环灌注和物质交换上起着重要作用，同时，红细胞的这种变形可使其适应外部流场变形，使血液的内摩擦力减小，血液表现黏度下降。临床发现[5,120]，一些脑血管疾病，心肌梗塞病人，红细胞变形能力均有不同程度降低，因此，能改善红细胞变形能力的药物对防治血管栓塞性疾病有十分重要意义。唐玉[121]等的研究还发现PAA与人参多糖均可加速红细胞的滤过速度，改善红细胞的变形能力，从而降低血液黏稠度，促进动脉粥样硬化等疾病的痊愈，但这是否与PAA的抗肿瘤活性有关，目前尚不清楚。
肿瘤血行性转移是一个非常复杂的过程，影响肿瘤转移的因素也比较多，目前研究认为主要与机体血凝状态和免疫功能等因素有关。机体的“血栓素A2－前列腺环素”平衡调节系统在维持血管壁的完整性、调节血小板功能以及对凝血和血栓形成过程均有重要作用。Honn[10]等认为，血小板聚集受血栓素A2－前列腺环素的比例所控制，并由此抑制或促进肿瘤血行性转移。试验观察到PAA对荷瘤小鼠血浆血栓素A2有较强的抑制作用，同时也抑制前列腺环素的合成，血栓素A2/前列腺环素比值变化较小，提示PAA可能与通过影响血栓素A2/前列腺环素比值而抑制肿瘤转移的可能性较小[121]。另一方面，Siegel[21]也曾推测红细胞在阻止癌细胞血行性转移方面有重要作用，可通过C3b受体黏附已激活的黏附补体的肿瘤细胞，从而增强吞噬细胞的吞噬、降解作用，防止癌细胞的血行性转移[16,122]。实验证明，PAA可使荷瘤小鼠红细胞免疫功能全面上升[123]。李娜[124]等（1996）研究，红细胞免疫功能下降的荷瘤小鼠，以PAA治疗后，荷瘤小鼠的红细胞C3b（RBC-C3b）受体花环率红细胞免疫复合物花环率（RBC-IC）均明显上升，血清中红细胞C3b受体免疫粘附促进因子活性上升，而抑制因子活性下降，提示PAA可恢复和提高荷瘤机体红细胞免疫功能,也说明了红细胞的免疫功能是机体抗肿瘤作用的机制之一。因为许多癌细胞的表面覆盖有抗体和补体，通过红细胞C3b受体（CR1），癌细胞可粘附于红细胞，并形成较大复合体，从而易被吞噬细胞捕捉、吞噬。机体红细胞免疫功能的检测可作为肿瘤发生，发展的指标之一。
PAA作为一种生物活性多糖类物质，具有广泛的生物活性，这一点在医疗上通过30多年的临床实践，证明其作用效果是确实的，可靠的。近年来，参与研制PAA的一些科研单位、企业逐步将PAA用于家畜、家禽疾病的预防和治疗上，在临床实践中取得了较好的效果，现在一般认为其具有增强动物免疫功能，提高机体对各种疾病的抵抗力，具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染和黏膜修复作用，并能促进动物对营养物质的吸收和利用，但PAA在预防和治疗动物疾病上的作用机制研究的还较少，可参考资料有限，相信随着PAA在畜禽上的不断应用，对其作用机理的研究也将越来越多，会更加深入，为该药物在动物疾病的防治上提供科学性依据，更好地发挥PAA在防治动物疾病、保障动物健康方面的重要作用。
第二章增益素（多抗甲素）对疫苗免疫后鸡免疫功能的影响
免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质按其性质可分为生物免疫增强剂、细菌免疫增强剂、化学免疫增强剂和中草药免疫增强剂等。现已证明，具有免疫增强作用的物质不下几十种，常用的有蜂胶、福氏佐剂、油佐剂、维生素E、左旋咪唑、转移因子和干扰素等[125,126]。然而，市售免疫增强剂大多制备复杂，价格昂贵，有的还有副作用。
现代免疫学研究证明，机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成[127]。胸腺、脾脏和法氏囊是参与机体免疫应答的重要器官，因此，它们的发育程度直接关系着机体的免疫功能和防御能力[128,129]。T细胞和B细胞是参与机体特异性免疫应答的主要细胞，在抗原作用下，T细胞参与细胞免疫过程，同时协助B细胞完成体液免疫应答。参与淋巴细胞再循环的免疫细胞大多数是T细胞，因此，T细胞正常比值变化可以反映机体的免疫功能状况[130]。单核巨噬细胞是一种重要的非特异性免疫细胞，在机体非特异免疫中发挥着重要作用，它具有强大的吞噬作用，能消灭病原体，消除异物，清除体内衰老死亡细胞以及吞噬抗原等；它还有细胞毒作用，能够靠近靶细胞，使靶细胞表面的抗体Fc段与其Fc受体结合,使其产生多种活性物质，这些物质对感染病原体的细胞、肿瘤细胞、异型或变形的细胞都有强大的杀伤作用；同时巨噬细胞还有提呈抗原的作用，识别和处理抗原物质，将抗原信息传递给T细胞或B细胞；在免疫过程中，巨噬细胞还能释放细胞因子，影响T细胞和B细胞的功能[131]。
多抗甲素（polyactin A,pAA），是从α-溶血性链球菌培养液中提取的α-甘露聚糖肽类物质，在低浓度下即可激活机体细胞免疫和体液免疫机能，具有免疫调节作用。在小鼠上研究证明，多抗甲具有抑制肿瘤细胞生长与代谢，促进造血干细胞生长，增强网状内皮系统吞噬活性，促进免疫细胞活化增殖及特异抗体生成，改善机体应激能力及抗炎等多种生理活性。
近年来，关于PAA的药理活性已进行了不少研究，初步证明其为一种新型免疫增强剂，在人医临床治疗中对病毒病、免疫缺陷等多种疾病有较好的疗效，但其确切机理尚未完全探明，特别是在动物疾病防治上的机理研究更少。PAA作为一种免疫增强剂，它在畜禽疾病预防和治疗上取得了良好的效果。本试验以雏鸡为动物模型来研究PAA（其产品商品名为增益素）对鸡接种新城疫疫苗后的免疫功能（T、B细胞和巨噬细胞吞噬功能）的影响，及对动物疾病防治的作用，从而更好地发挥其在动物疾病防制方面的作用。
§2.1材料
§2.1.1试验动物
1日龄尼克红公雏，购自西北农林科技大学动物科技学院种鸡场，隔离饲养1周。健康成年公鸡2只，购自杨凌集贸市场，供采血用。
§2.1.2疫苗
鸡新城疫（克隆株）、传染性支气管炎（H120）二联弱毒活疫苗：南京市畜特家禽科学研究所生产，批号020101。
鸡新城疫多价油乳剂灭活苗：农业部动物检疫所生物制品生产车间生产，批号20020122。
§2.1.3增益素
西安亨通光华制药有限公司生产，批号011114。
§2.1.4主要试剂
（1）丙酮：河南焦作市化工三厂生产，批号840828。
（2）甲醇：信阳市化学试剂厂生产，批号3515。
（3）瑞氏色素：上海试剂三厂生产，批号811215。
（4）瑞特氏染液：按文献[128]的方法配制。
（5）4%可溶性淀粉溶液：按文献[129]的方法配制。
（6）新城疫4单位抗原：由购自中国兽药监察所的新城疫Lasota标准株标定而成。
（7）RBC悬液：挑选健康的罗曼公鸡2只，翅静脉采血，加枸橼酸钠抗凝，以3000r/min离心5min，去其上清液，沉淀物用不同pH的生理盐水洗涤，反复离心5次，最后一次离心20min，弃上清液，按RBC压积配制成1%和5%的RBC混悬液[134]。
（8）pH7.0的生理盐水：NaClAR级，天津市东丽区天大化学试剂厂生产。
（9）台盼蓝及其染色液（trypan Blue）：Sino-American Biotec生产，批号0109BS1121。①2%台盼蓝水溶液:称取台盼蓝染料2g,置研钵内边研边磨加蒸馏水溶解。②1.7%NaCl水溶液。临用前取①②液等量混合，离心沉淀10min，取上清供染色用。[10]
（10）Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（10倍浓缩液）：每1000mL（10倍浓缩）溶液所含试剂的量①甲液：NaCl 80.0g，KCl 4.0g，CaCl2 1.40g，MgSO4 2.0g②乙液：Na2HPO4•12H2O 1.52g，KH2PO4 0.60g，葡萄糖10.0g，1%酚红16.0mL甲液与乙液均溶于400mL的双蒸水中，然后将乙液缓缓加入甲液，边加边搅，补加双蒸水到1000mL。此10倍浓缩液用双蒸水稀释10倍，然后以108℃磅高压灭菌10min。应用时按1.25%加入2.8%碳酸氢钠液以起缓冲作用。
（11）RPMI-1640溶液：由GIBCOBRL生产，批号1099213。
取RPMI-1640一袋，倾入1000mL容量瓶中，并用四蒸水洗净袋内残余试剂一并加入容量瓶内，之后加适量四蒸水于容量瓶，不断摇动使固体RPMI-1640充分溶解，最后加四蒸水至刻度，将pH调至7.2～7.4，抽滤除菌后分装，4℃保存，同时进行无菌检验。
（12）不完全RPMI-1640培养液[132]：组成物质含量为，RPMI-1640溶液94.0mL；0.1mol/L丙酮酸钠1.0mL；0.2mol/L L-谷胺酰胺1.0 mL；1.0mol/L HEPES1.0mL；5×10-3mol/L 2-Me1.0mL；7.5%碳酸氢钠1.0mL；抗生素溶液1.0mL。
给不完全RPMI-1640培养液中加入灭活的FCS（犊牛血清），即为完全RPMI-1640培养液。FCS含量15%，配制后4℃保存。
（13）丙酮酸钠：AMRESCO分装，批号3459A56CAS#113-24-6。用前配成1.0mol/L溶液，过滤除菌，-20℃保存。使用前稀释成0.1mol/L溶液。
（14）L-谷胺酰胺：AMRESCO分装，批号1490B40CAS#56-85-9。用前配成0.2mol/L溶液，滤过除菌，-20℃保存。
（15）HEPES：AMRESCO分装，批号1207AOO CAS#73695-45-9。配成1mol/L溶液，过滤除菌，-20℃保存。
（16）二巯基乙醇（2-Me）：AMRESCO分装，批号0321SO1 CAS#60-24-2。配成0.05mol/L，-20℃保存，使用时稀释成5×10-3mol/L，过滤除菌后应用。
（17）7.5%碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠（西安化学试剂厂生产，批号010410）7.5g，溶于100mL四蒸水中，108℃15min灭菌后，4℃保存。
（18）抗生素溶液：双氢链霉素1.0g；青霉素G钾100万IU；卡那霉素1.0g；Hank’s液100mL。溶解后抽滤除菌，分装置—20℃保存。
（19）犊牛血清（FCS）：杭州四季青生物工程公司生产，批号20011216。
（20）肝素溶液：称取肝素钠（Heparin Na,）Sino-American Biotec产品，批号0203BC0322）10.0mg溶于100mL Hank’s液中，过滤除菌后，—20℃保存。
（21）噻唑兰（MTT）：AMRESCO分装，批号3460B39。以预温至37℃的RPMI-1640完全培养液配制，过滤除菌，避光保存，使用浓度为5mg/mL。
（22）植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）：Sino-American Biotec产品，批号10K7606。使用时以完全RPMI-1640培养液配制，浓度为20μL/mL。
（23）异丙醇：天津市津东天正精细化学试剂厂生产，批号2000.11.18。
（24）淋巴细胞分离液（Lymphocytes separation medium）：上海华精生物高科技有限公司生产，批号010708。
§2.1.5主要器材
CO2培养箱：德国Heraeus公司生产。
XSZ-G光学显微镜：重庆光学仪器厂生产。
DG5031型酶联免疫检测仪：华东电子集团公司医疗电子仪器厂生产。
LD4-2离心机：北京医用离心机厂制造。
96孔V型医用血凝滴淀板：江苏省泰县医疗器械厂生产。
96孔细胞培养板：（NUNCLONTMsurface）Made in Denmark。
40～200μL芬兰数字显示移液器：上海雷勃分析仪器有限公司生产。
10ul移液器:Manufactured in poland for Denville Scientific,Inc。
温箱，血球计数器，电子天平，普通光学显微镜，普通水平式离心机，台式高速度离心机，水浴锅，吸管，巴氏管，5mL离心管，1mL离心管，小青霉素瓶等。
§2.2方法
§2.2.1试验鸡的分组及处理
7日龄尼克红公雏350只,随机分为4组，每组80只，平均体重45.04±0.63g/只。4组雏鸡都用鸡新城疫（克隆株）、传染性支气管炎（H120）二联弱毒活疫苗滴鼻、点眼，0.1mL/只；第1组和第3组雏鸡从7日龄开始，按体重于饮水中添加增益素，0.2mg/kg/日，连用2周；第2组和第4组为对照。14日龄时用鸡新城疫多价油乳剂灭活苗对第1组和第2组雏鸡加强免疫，颈部皮下注射，0.2mL/只；第3和第4组雏鸡不加强免疫。
§2.2.2试验鸡血清NDV抗体的测定
于首次免疫接种后第0d、3d、10d、15d、21d和27d，从1，2组随机抽取8只鸡，采心血分离血清，－20℃保存待检。采用微量血凝抑制试验[133,134]（HI）检测鸡血清NDV
抗体效价，按下式计算HI抗体效价加权平均值：ＨI抗体效价加权平均值＝X、Y、Z为不同的HI抗体效价；a、b、c为相应的被检鸡数，N为被检鸡总数。
§2.2.3外周血T淋巴细胞活化情况测定
于首次免疫接种后第10d、15d、21d和27d从4组分别随机抽取8只鸡，无菌采心血分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMI）并进行淋巴细胞功能测定，采用丝裂原刺激的淋巴细胞增殖反应，来测定T淋巴细胞的活化情况。按文献[135，136]方法，稍加改动。具体方法如下：
（1）无菌从心脏采集肝素抗凝血（每1mL全血加0.1mL 150u/mL肝素溶液）1mL，注入盛有等体积室温HBSS的无菌小瓶中，使血液等倍稀释。
（2）吸取1mL淋巴细胞分离液置于5mL离心管中，然后将离心管倾斜45°角，将稀释血液在距分离液界面上1cm处沿管壁缓慢加至分离液面上，应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分离液内。
（3）将离心管置于水平式离心机内，室温下以2000r/min离心30min。离心结束后，管内可分为以下4层；上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分离液；分离液与血浆交界部位灰白色层，即单个核细胞层。
（4）用巴氏管沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞（PBMC），盛入1mL离心管中。
（5）将所得的PBMC用5倍体积的HBSS洗涤2次，将离心管置于台式高速离心机内依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，弃上清。
（6）用适量完全RPMI-1640培养液定容细胞，调整细胞浓度至1×106～2×106个/mL。
（7）取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染色液染色5min，低倍镜下检查200个细胞活率，活细胞不着色，死细胞染成蓝色，一般要求活细胞在95%以上。
（8）将上述细胞悬液加到96孔细胞培养板中，100μL/孔，其中前4排孔加PHA（50μL/孔），后4排孔不加PHA。置5%CO2培养箱中37℃培养70h，然后加入MTT（5mg/mL），10μL/孔，继续培养4～6h。细胞培养终止后，加盐酸异丙醇（0.04mol/L）100μL/孔，充分混匀，静置数分钟，用DG5031型酶联免疫检测仪测定各孔OD值，测定波长为550nm。以刺激指数（SI，又称活化指数），作为判断淋巴细胞转化程度的指标，按下列公式计算SI：
 
§2.2.4鸡腹腔巨噬细胞吞噬活性的检测
于首次免疫接种后第10d、15d、21d和27d从4组分别随机抽取8只鸡检测腹腔巨噬细胞吞噬活性。具体方法如下[137,138]：
（1）试验前10~12h，每组随机抽取8只鸡，于腹腔内注射4%无菌可溶性淀粉溶液，1.0mL/只，试验前30min对试验鸡腹腔注射5%鸡红细胞悬液，2mL/只。
（2）脱颈处死实验鸡，按无菌操作打开腹腔，用无菌吸管吸取腹腔液涂片。然后将载玻片放入铺有湿纱布的有盖搪瓷盒中，置于37℃温箱中孵育30min，使巨噬细胞充分粘附于载玻片上。
（3）取出后用生理盐水快速漂洗一下，洗去其它未粘附细胞，滴加丙酮－甲醇（1:1）液固定5min，再滴加瑞氏染液1~3滴，染色1~3min后，再加等量的蒸馏水，晃动载玻片使之与染料混合，继续染色5min后，用蒸馏水冲洗掉多余的染液后，自然风干。
（4）在10×40倍显微镜下观察计数。每张涂片数100个巨噬细胞，观察巨噬细胞吞噬红细胞的情况，统计被吞噬的红细胞个数，计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，按下列公式计算：
吞噬率=（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数）×100%
吞噬指数=（被吞噬的鸡红细胞数/巨噬细胞总数）×100%
§2.3结果
§2.3.1增益素对鸡血清抗体水平的影响
 

 
由表1和图1可以看出，免疫接种前第1组和第2组鸡母源抗体完全一致。鸡新城疫弱毒苗免疫接种后第3d两组鸡的抗体效价都开始升高，但差异不显著；接种后第10d（鸡新城疫油佐剂苗加强免疫接种第3d后），第1组鸡抗体效价迅速升高到8.80log2，与第2组相比，差异极显著（P﹤0.01）。此后，两组鸡的抗体效价都开始下降，但第1组鸡的抗体效价一直高于第2组鸡；弱毒苗免疫接种后第21d（加强免疫接种第14d后），第1组鸡抗体效价仍然比第2组高，差异极显著（P﹤0.01）。
§2.3.2增益素对淋巴细胞活性的影响
增益素对PHA刺激的T淋巴细胞增殖活性的影响见表2、表3、图2、图3。
 
 
由表2和图2可以看出，首次免疫接种后第10d（鸡新城疫油佐剂苗加强免疫第3d后），第1组鸡和第2组鸡T淋巴细胞活化指数无差异；此后，两组鸡的T淋巴细胞活化数均开始升高，但第1组鸡的T淋巴细胞活化指数一直高于第2组鸡。免疫接种后第21d（ND油佐剂苗加强免疫第14d后），第1组鸡T淋巴细胞活化指数与第2组相比，差异显著（P＜0.05）；免疫接种后第27d（ND油佐剂苗加强免疫第20d后），差异极显著（P＜0.01)。
 
 
由表3和图3可以看出，只进行了首次免疫接种，而未加强免疫的2组鸡，在免疫接种后第10d，2组鸡的T淋巴细胞活化指数无差异；此后，两组鸡的T淋巴细胞活化指数均开始升高，但第1组鸡的T淋巴细胞活化指数一直高于第2组鸡。免疫接种后第27d第3组鸡的T淋巴细胞活化指数与第4组相比，差异显著（P＜0.05)。
§2.3.3试验鸡腹腔巨噬细胞吞噬率
免疫接种后第10d、15d、21d、27d各组鸡腹腔巨噬细胞吞噬率见表4。
 
从表4可以看出，在免疫后10d、15d、21d、27d鸡腹腔巨噬细胞吞噬率的统计情况是，饲喂增益素组均高于相应的对照组。第1组比第2组分别高出3.57%、8.20%、7.05%、7.40%,第3组比第4组分别高出13.40%、4.60%、3.75%、8.00%,其中在免疫后第10d，第3组与第4组差异显著（p<0.05）。
§2.3.4试验鸡腹腔巨噬细胞吞噬指数
首次免疫接种后第10d、15d、21d、27d各组鸡腹腔巨噬细胞吞噬指数见表5。
 
从表5可以看出，在首次免疫接种后10d、15d、21d、27d，鸡腹腔巨噬细胞吞噬指数统计的总体情况是，饲喂增益素组均高于相应的对照组。加强免疫的第1组比第2组分别高7.71%、15.20%、10.65%、10.00%，在首次免疫接种后15d，第1组与第2组差异显著（p<0.05）。未加强免疫的第3组比第4组分别高出17.00%、4.60%、3.60%、10.30%，在首次免疫接种后10d，第3组与第4组差异显著（p<0.05）。
§2.4讨论
§2.4.1从试验鸡血清抗NDV抗体水平测定结果可以看出，饲喂增益素的鸡接种新城疫疫苗后，其血清抗体水平在不同的测定时间内均高于不饲喂增益素的鸡；在免疫接种后第10d和21d明显高于不饲喂增益素的鸡（p﹤0.01）。在油佐剂疫苗加强免疫后3d，2组鸡血清特异性抗体效价都升到较高水平，但第1组明显较第2组高（p﹤0.01）。此后2组鸡血清特异性抗体开始下降，但第1组下降到一定水平后维持在一定范围内，变化较小；而第2组鸡从加强免疫后8～14d都处于下降状态，在加强免疫后14～21d血清特异性抗体呈现升高的趋势，但仍低于第1组，可见增益素可使机体在弱毒疫苗免疫、油佐剂疫苗加强免疫后，在较短的时间内产生免疫应答，并产生较高水平的特异性抗体，而且维持时间较长。说明增益素可以增强机体体液免疫功能。
§2.4.2通过对免疫应答的机制研究发现，胸腺依赖性抗原其单纯的B细胞表位尚不能介导体液免疫，必须在T细胞表位介导的细胞免疫辅助下才能产生有效的体液免疫应答。因而，T淋巴细胞的活化在动物免疫应答中起着中心作用[139]。鸡新城疫病毒抗原是T淋巴细胞依赖性抗原，从免疫鸡T淋巴细胞的激活程度亦可反映出疫苗的免疫效力[140]。从各组鸡的T淋巴细胞活化指数的测定结果可以看出，饲喂增益素的鸡淋巴细胞活化指数在不同的测定时间内均高于相应的对照组；在首次免疫接种后21d（p﹤0.05）和27d（p﹤0.01）明显高于不饲喂增益素的鸡，说明增益素可以刺激机体免疫细胞，提高其在丝裂原作用下的增殖能力，是淋巴细胞活化指数升高。
§2.4.3巨噬细胞具有强大的吞噬能力，还有细胞毒作用及抗原加工和提呈作用。鸡红细胞作为一种异体性抗原物质,可引起腹腔巨噬细胞聚集并吞噬。因此，可以检测增益素对免疫鸡腹腔巨噬细胞活性的影响。试验结果表明，饲喂增益素的鸡，其腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均高于相对应未饲喂增益素的鸡。在首次免疫接种后10d，未加强免疫的两组鸡，饲喂增益素组与不喂增益素组差异显著（P<0.05）。此结果说明增益素能直接提高免疫鸡腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，即能增强巨噬细胞的活性。
§2.4.4本次实验结果表明，增益素对鸡体特异性免疫和非特异性免疫功能都有一定的促进作用。细胞免疫和体液免疫是机体免疫系统不可分割的有机整体，增益素一方面可以激活机体的体液免疫功能，使产生特异性抗体的能力加强；同时也可有效地激活机体的免疫细胞，提高其活性，提高细胞裂殖速度和对异物的黏附、吞噬能力。从而可以调整机体的免疫系统，使鸡获得更为持久和坚强的免疫力。
第三章增益素（多抗甲素）对肉鸡抗大肠埃希氏菌
感染和增重的作用
鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种常见病，各品种各日龄的鸡均可发病，但肉仔鸡最易感[141]。一般认为其致病机理是进入易感宿主小肠内的大肠杆菌，以其黏附性菌毛与小肠上皮细胞的微绒毛表面受体结合，黏覆于肠壁，从而定居于肠内，迅速繁殖，同时释放肠毒素，对其靶细胞产生毒性作用，使肠绒毛吸收功能降低，从而造成水分和电解质大量积蓄于肠管中，引起临床上的水样腹泻和迅速脱水症状[142]。若细菌进入血液，还会引起菌血症，甚至败血症，致使多个器官发生严重病变，如气囊炎、肝周炎、心包炎等等。本病发病率和死亡率较高，是对养鸡业有严重危害的疾病之一[143]。多抗甲素在结构上属于一种甘露聚糖肽，当其进入动物消化道后，会被消化酶分解为甘露聚糖（低聚甘露糖）和碱性多肽两部分，而甘露聚糖经相应酶的不完全水解产生甘露寡糖（MOS），通过这几种生物活性物质来发挥重要的作用。甘露聚糖对病原菌具有一定的吸附作用，可以干扰肠道病原菌的定植，从而打断了病原菌附着－繁殖－致病的途径，并携带病原菌排出体外。甘露寡糖（MOS）因其特有的糖苷键（α－1，4糖苷键）不能被动物消化酶利用，肠道内的有益菌（双歧杆菌和乳酸菌）却能很好的利用MOS而能大量繁殖；相反，大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌则不能利用MOS，使其饥饿而死。酯代葡甘露聚糖（Esterified glucomannas）是一种较好的霉菌毒素结合剂，减少霉菌毒素对动物的毒副作用，降低霉菌毒素的免疫抑制作用。多抗甲素可以加强机体对营养物质的消化吸收。MOS通过发酵产生短链脂肪酸，降低pH值，抑制有害菌的生长，同时也刺激消化道的蠕动，而且通过微生物区系的改变而改变肠道形态（肠绒毛高度、腺窝深度），更加有利于营养物质的消化吸收[96,97,98]。我们通过给肉仔鸡饲喂增益素，观察人工感染致病性大肠杆菌肉鸡的发病率和死亡率，并统计增重情况，从而探讨增益素对鸡的抗感染能力和促进生长的作用。
§3.1材料
§3.1.1试验动物
1日龄艾维因肉仔鸡100只,购自陕西正大集团。
§3.1.2菌种
由西北农林科技大学预防兽医学教研究室提供的2株致病性大肠埃希氏菌，血清型为O2。
§3.1.3增益素(Polyactin A,PAA)
由西安亨通光华制药有限公司生产，批号：011114。
§3.1.4庆大霉素
陕西省西安制药厂生产，批号：020311。
§3.1.5培养基制备
（1）麦康凯琼脂：准确称取蛋白胨2.0g、琼脂2.0g、氯化钠0.5g、胆盐0.5g、乳糖1.0g，将以上成分加入100ml蒸馏水中，加热溶解，调pH至7.2，煮沸，用纱布脱脂棉过滤，加入1﹪中性红水溶液摇匀，分装于烧瓶中以116℃高压蒸气灭菌15min。然后倾注平板，4℃保存备用。
（2）营养肉汤：准确称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g，加入1000ml蒸馏水中，调pH7.4～pH7.6，再加热5min，补足水分；待凉后用滤纸过滤，分装于试管中，121℃高压蒸气灭菌20min。
§3.1.6饲料
肉蛋杂用雏鸡颗粒料,陕西新华秦饲料有限公司订做,不含抗生素,40kg/袋。
肉小鸡全价配合饲料,陕西正大饲料有限公司生产（Q/SXCT001～2001）,40kg/袋。
§3.1.7稀释液
灭菌生理盐水:将氯化钠按0.9%有比例加入蒸馏水中,混匀,121℃灭菌20min备用。
§3.2方法
§3.2.1菌种的准备
将2株治病性大肠埃希氏菌（血清型为O2）经麦康凯琼脂培养基进一步纯化后，分别接种于营养肉汤,37℃培养18～24h,4℃保存备用。
§3.2.2试验菌的半数致死量测定
用麦氏比浊法[144]测得2株菌所选菌株的肉汤培养物的含菌量为1.5×109/mL，将其按1:1混合，倍比稀释成5个梯度，取每个稀释度经口接种7日龄雏鸡6只，观察其发病、死亡情况。7d后对存活鸡宰杀，剖检，观察其病理变化并记录[145,146,147,148,149]。用Reed和Muench法[144]计算，试验菌株的半数致死量（LD50）为2.5×108/mL。
§3.2.3试验方法
将90只1日龄艾维因肉仔鸡随机分成3组,每组30只,第1、2组为试验组，从1日龄开始按体重于饮水中添加增益素，每日0.2mg/kg，连用2周；第3组不饮用增益素为对照组。在7日龄时对各组试验鸡通过嗉囊注射致病性大肠埃希氏菌，含菌量为3.0×108/只。人工感染后24h后出现症状，给第1组鸡于每1000ml饮水中加入4万U庆大霉素，连续饮用3d；第2组不添加庆大霉素；第3组不饮用增益素也不用庆大霉素。观察各组鸡发病及死亡情况，计算发病率及死亡率。在试验过程中从1日龄开始每7d从各组鸡随机抽取10只称重，计算平均体重、增重率和料肉比。
§3.3结果
§3.3.1人工感染雏鸡的发病和死亡情况
人工感染致病性大肠埃希氏菌的雏鸡10d内发病和死亡情况见表1。10d后存活的
试验鸡临床症状消失，再无新病例出现。
 
由表1可见，第1、2组试验鸡的发病率、死亡率明显低于第3组，说明增益素对致病性大肠埃希氏菌有一定的抵抗作用；第1组的死亡率低于第2组，表明增益素与抗生素合用效果更好。
§3.3.2不同日龄各组试验鸡增重情况
试验鸡在1、7、14、21、28、35日龄时，分别从每组抽取10只鸡称重，计算每组鸡的平均体重和每周的平均增重率，统计结果见表2和表3。
 

由表3可以看出，试验鸡从1日龄开始饲喂增益素，试验组鸡在每周内的平均增重率均高于对照组，在2周时与对照组比较差异极显著（p﹤0.01），且随着饲养期的延长，这种差异性也逐渐变小。在7日龄感染致病性大肠埃希氏菌后，在饮水中添加增益素并用抗生素治疗的试验鸡，第1组鸡的周平均增重率在测定时间内均高于饲喂增益素但不配合抗生素治疗的第2组试验鸡。说明，增益素对肉鸡的生长有一定的促进作用，配合抗生素对疾病的治疗，增重效果更好。
§3.3.3不同日龄各组试验鸡的平均累积料肉比
从1日龄起每日统计每组鸡所消耗的饲料量，计算每周各组试验鸡的平均累积料肉比，见表4。料肉比＝消耗饲料的量（kg）/增加肉的量（kg）
 
由表4可以看出，第1、2组鸡的平均累积料肉比从14日龄开始均较第3组鸡低，说明饲喂增益素可降低料肉比，增加饲料转化率。
§3.4讨论
§3.4.1本试验结果表明，给雏鸡饮水中添加增益素，可抵抗致病性大肠埃希氏菌的致病作用，降低动物的发病率和死亡率；出现症状后给予庆大霉素的试验鸡死亡率更低，说明增益素与抗生素联合使用对治疗鸡大肠杆菌病效果更好。进一步在肉鸡上证实，增益素对肠道菌有清除作用，主要因为增益素为低分子甘露聚糖肽，其结构与动物肠道黏膜细胞上的能与病原菌特异结合的特异性糖受体的结构相似，能竞争地与病原体结合，使病原菌无法结合到肠壁上而得不到养分无法繁殖，而发挥对肠道致病菌的清除作用。
§3.4.2结果显示，在雏鸡饮水中添加增益素可使鸡的体重明显加强，可降低料肉比，这主要是因为增益素为低聚糖类分子，可促进肠道后部的乳酸杆菌，双歧杆菌等肠道有益菌生长繁殖，而大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌则不能利用低聚糖[150]。有益菌可合成动物所必需的维生素如B1、B2、B12，叶酸和消化酶等，可促进动物对营养物质的消化和吸收。另外，有益菌的代谢产物如有机酸、过氧化物、抗生素等物质，可抑制和杀灭病原微生物，乳酸杆菌产生的挥发性脂肪酸使肠道pH值降低，还可促进Ca、P、Mg、Fe等矿物质的吸收[151,152]，可见增益素有促进动物增重的作用。
结论
1.口服增益素（多抗甲素）后，ND疫苗免疫鸡血清抗NDV抗体,在免疫接种后均高于对照组，在第10d和21d差异显著（p﹤0.01），说明增益素（多抗甲素）对鸡体液免疫功能有促进作用，可增加抗体生成量。
2.添加增益素（多抗甲素）的鸡淋巴细胞活化指数在免疫接种后第21d、27d都显著高于对照组（p﹤0.01或p﹤0.05），说明增益素（多抗甲素）对鸡外周血淋巴细胞活化具有一定的促进作用。
3.添加增益素（多抗甲素）组鸡巨噬细胞对异物的吞噬活性都较对照组高，在免疫接种后第10d差异显著（p﹤0.05），提示增益素（多抗甲素）可增强巨噬细胞吞噬活性。
4.添加增益素（多抗甲素）组鸡在受致病性大肠埃希氏菌感染后的发病率和死亡率都较对照组低，且差异显著（p﹤0.01或p﹤0.05）。其增重率也较对照组鸡高，在第14d，尤为明显（p﹤0.01）。说明增益素（多抗甲素）可抵抗鸡肠道致病性大肠埃希氏菌的感染，并有一定的促生长作用。
致谢
本论文是在导师张彦明教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、试验设计与实施，到论文撰写的整个过程，处处都凝聚着导师的心血。几年来导师在学习和科研上言传身教，在精神上热情鼓励，在生活上关怀备至，指引我在科学的高峰上不断攀登。老师严谨的治学态度、一丝不苟的敬业精神、为人正直的品格、广博的学识和严谨的学风、对事业孜孜不倦的执着追求以及豁达积极的人生态度，为我树立了良好的典范。我在教学和科研上的每一个进步都凝聚着导师的心血。值此论文完成之际，首先向我尊敬的导师张彦明教授致以崇高的敬意和诚挚的感谢！
特别感谢张彩虹硕士、李贺硕士、孙裴硕士、魏中锋硕士、陈宝玉硕士在试验过程中的大力帮助，试验能够顺利完成与他们的帮助是分不开的！
衷心感谢于三科教授、杨增歧教授、陈德坤副教授、王晶钰副教授等在论文的开题论证和实验设计上提出了许多宝贵的意见和建议！
衷心感谢靳亚平副教授、王爱华副教授、周宏超博士、邢福珊博士、许信刚博士、林青博士、安志兴博士、吕长荣硕士、张耀相老师、王虹老师以及陈建明、张越男等同学在试验中的指导、关心和帮助！
衷心感谢师母郑丽仙老师在学习和生活上给予关心和帮助！。
诚挚感谢家乡的亲人默默的付出；岳父母的关心和鼓励；爱妻在生活上关心和体贴，在工作上的支持和理解，正是他们的殷殷厚望和无私奉献才使我能够全身心的投入到学习和科研中去！。
感谢我所有的亲人、朋友和师友给予我的照顾和支持！
值此论文完成之际，感激之情，难以尽述。谨向所有关心、支持、帮助和指导我完成学业的老师、同事、同学、朋友及家人表示深深的谢意！
最后，向论文评阅人和答辩委员会的所有专家、教授表示最衷心的感谢！
郭抗抗
2003年12月